Abstract: Background: GM1 gangliosidosis (GM1) is an autosomal recessive disorder characterized by the deficiency of beta-galactosidase (β-gal), a ubiquitous lysosomal enzyme that catalyzes the hydrolysis of GM1 ganglioside.
Objective: The study aims to explore the application of the AAV9-coGLB1 for effective treatment in a GM1 gangliosidosis mutant mouse model.
Methods: We designed a novel adeno-associated virus 9 (AAV9) vector expressing β-gal (AAV9-coGLB1) to treat GM1 gangliosidosis. The vector, injected via the caudal vein at 4 weeks of age,drove the widespread and sustained expression of β-gal for up to 32 weeks in the Glb1G455R/G455R mutant mice (GM1 mice).
Results: The increased levels of β-gal reduced the pathological damage occurring in GM1 mice. Histological analyses showed that myelin deficits and neuron-specific pathology were reduced in the cerebral cortex region of AAV9-coGLB1-treated mice. Immunohistochemical staining showed that the accumulation of GM1 ganglioside was also reduced after gene therapy. The reduction of the storage in these regions was accompanied by a decrease in activated microglia. In addition, AAV9 treatment reversed the blockade of autophagic flux in GM1 mice.
Conclusion: These results show that AAV9-coGLB1 reduces the pathological signs of GM1 gangliosidosis in a mouse model.
目的：ＧＭ１神经节苷脂贮积症是一种由半乳糖苷酶ｂｅｔａ１（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｂｅｔａ１，ＧＬＢ１）基因突变引起的β-半乳糖苷酶（β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，β-ｇａｌ）活性降低导致的严重的溶酶体贮积病。该病以进行性、致命性神经退行性病变为特征，目前尚无有效的治疗手段，ＡＡＶ载体介导的基因治疗被认为是最有希望的治疗方法。通过基因定点突变获得具有较高β-ｇａｌ活性的ＧＬＢ１突变体，以期用于后续ＡＡＶ介导的基因治疗。
方法：对人类和其他６种脊椎动物ＧＬＢ１基因进行多序列比对分析，筛选出部分氨基酸位点进行定点突变，采用携带突变位点的重组质粒和ＡＡＶ９载体转染或感染ＨＥＫ-２９３细胞，比较突变体与未突变体的活性差异。对ＧＭ１模型鼠注射携带ｃｏＧＬＢ１-Ｒ２９９Ｌ的ｒＡＡＶ９病毒，探究该突变体的体内活性表达。
结果：从１５个突变体中筛选出ｃｏＧＬＢ１-Ｒ２９９Ｌ突变体，经质粒转染导入细胞后，其β-ｇａｌ活性比具有野生型氨基酸序列的ｃｏＧＬＢ１增加了３０％ ～４０％。ＡＡＶ体外感染实验中，ｒＡＡＶ９-ｃｏＧＬＢ１-Ｒ２９９Ｌ组的β-ｇａｌ活性较未感染的细胞对照组提升了约２．２倍。体内结果显示，ｒＡＡＶ９-ｃｏＧＬＢ１-Ｒ２９９Ｌ在模型鼠体内广泛表达，心脏、肝脏、脾脏、肺、脑组织中β-ｇａｌ活性显著提升。
结论：获得了具有更高β-ｇａｌ活性的突变体ｃｏＧＬＢ１-Ｒ２９９Ｌ，初步探究了ｒＡＡＶ９-ｃｏＧＬＢ１-Ｒ２９９Ｌ的体外表达效果和模型鼠体内β-半乳糖苷酶的表达与分布，为该突变体应用于ＡＡＶ介导的ＧＭ１神经节苷脂病治疗奠定基础。
目的：蓬佩病是一种由酸性α-葡糖苷酶（ＧＡＡ）缺乏引起的溶酶体糖原贮积症，病理特征是糖原在心脏、骨骼肌和中枢神经系统中累积。基因治疗有望成为治疗蓬佩病的突破性手段。采用ＡＡＶ９载体在蓬佩病模型小鼠体内介导ＧＡＡ基因转移，评估转基因干预后小鼠体内ＧＡＡ酶活力变化、组织糖原累积及病理改变。
方法：采用ＡＡＶ９载体携带密码子优化的ＧＡＡ基因（ｃｏＧＡＡ），通过杆状病毒生产工艺包装ＡＡＶ病毒载体ｒＡＡＶ９-ｃｏＧＡＡ，分别以１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．２×１０１４ｖｇ／ｋｇ的剂量静脉单次注射给予成年蓬佩病模型小鼠，以３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ的剂量静脉单次注射给予老龄蓬佩病模型小鼠。到达试验终点后安乐死小鼠，使用荧光分光光度法测定ＧＡＡ酶活力、ＰＡＳ染色观察糖原累积、ＨＥ染色检查病理变化。
结果：成年模型小鼠给药５周后，各个组织能够广泛表达具有活性的ＧＡＡ，其中心脏、肝脏表达水平较高，脑和脊髓表达水平较低。转基因干预后心肌、骨骼肌与脑中的糖原含量下降，心肌、骨骼肌的空泡样变性显著减少。老龄小鼠治疗后，组织酶活力与模型小鼠相比显著提升，心肌的空泡样变性和炎细胞浸润减少，但骨骼肌的病理改善有限。
结论：静脉单次注射ｒＡＡＶ９-ｃｏＧＡＡ在蓬佩病模型小鼠中能够提升ＧＡＡ酶活力，减少糖原累积并改善病理，治疗效果呈剂量依赖，对老龄小鼠也有一定治疗效果。为ＡＡＶ９静脉递送ＧＡＡ基因治疗蓬佩病的临床应用奠定了基础。
基因治疗正日益成为罕见病乃至单基因遗传病的首选治疗策略，提升基因药物的体内表达是重要研究领域。本文选择4 种短内含子构建了4 种嵌合型启动子CAR、CAS、CAP、CAT，通过Gluc 报告基因表达活性比较发现，CAR 强度明显高于CA，仅次于CAG。选择CAR 启动子构建和制备了携带EGFP 报告基因的重组病毒rAAV9-CAR-EGFP，经SDS-PAGE 分析可见病毒外壳蛋白条带清晰，表明纯度良好；Southern 杂交检测可见基因组以自身互补的双链DNA 为主。在新生小鼠和成年小鼠中用静脉注射（IV）和侧脑室注射（ICV）两种途径给药，研究了rAAV9-CAR-EGFP 的体内表达分布特性。结果表明，新生鼠ICV 注射rAAV9-CAR-EGFP 在其脑部和脊髓可以观察到EGFP 高转导效率和高强度表达，新生鼠IV 注射rAAV9-CAR-EGFP 可在脑组织观察到明确的EGFP 绿色荧光，表明该病毒可有效穿越血脑屏障，但IV 注射对于中枢神经系统的转导效率和表达强度明显低于ICV 注射。无论是IV 注射还是ICV 注射，神经和肌肉系统中都可观察到EGFP 的持续表达；同时还可以观察EGFP 蛋白在外周组织中广泛分布，其中以肝脏、骨骼肌和心肌最为显著。另外，成年鼠IV 注射rAAV9-CAR-EGFP 可在肝脏观察到EGFP 持续表达，而新生鼠IV 或ICV 注射则肝脏中EGFP 的表达会随动物生长而明显衰减。这些研究结果为我们下一步用AAV9 携带CAR 启动子介导目的基因表达治疗中枢神经系统疾病如脊髓性肌萎缩症的基因药物设计奠定了基础。